Известный русский художник конца 19 – начала 20 веков, мастер пейзажа, коллекционер. Член Товарищества передвижных выставок и Союза русских художников, участник Абрамцевского кружка, работал как театральный художник. Велика роль Остроухова как музейного деятеля и коллекционера. С 1899 он был членом Совета, а в 1905-1913 годах – председателем Совета и попечителем Городской художественной галереи братьев П.М. и С.М.Третьяковых.
С 1890-х годов начал систематически заниматься коллекционированием, в 1918 году на основе его собрания был открыт Музей иконописи и живописи, ставший филиалом ГТГ, а сам художник был хранителем (с 1919) и директором (с 1927) музея. После смерти Остроухова музей был расформирован, а большая часть произведений вошла в состав собрания Третьяковской галереи.